Comment faire un étalon pour une clhp

Déterminer le produit chimique que vous souhaitez tester en utilisant la HPLC (le «analyte»). Par exemple, vous voudrez peut-être tester une série de boissons gazeuses pour la teneur en fructose, auquel cas le fructose serait l`analyte.

Obtenir une certaine quantité du produit chimique de pureté approprié de l`analyte. Normalement, la pureté doit être supérieure à 99% et l`analyte doit être acheté auprès d`une compagnie de bonne réputation d`alimentation chimique. Dans le cas de fructose, par exemple, vous achèteriez fructose pur à partir d`un fournisseur de produits chimiques et non à partir d`un magasin d`épicerie.

Déterminer les maximales et minimales prévues des concentrations de l`analyte dans les échantillons que vous souhaitez tester sur la HPLC. Dans le cas des boissons gazeuses, vous examiner les étiquettes des boissons et de déterminer le contenu le plus bas et le fructose parmi les boissons que vous allez tester. Gardez à l`esprit que l`échantillon initial (la boisson gazeuse) peut être dilué ou autrement manipulé lors de la préparation pour l`analyse (en fonction de la méthode HPLC utilisé) et ainsi la concentration d`analyte dans les échantillons effectivement injectés sur la HPLC peut être modifiée. Il est la concentration en analyte dans les échantillons exécuté sur l`HPLC qui doit être prise en considération.

Déterminer le solvant dans lequel vous allez dissoudre votre analyte pour compenser les normes d`étalonnage. Ce solvant doit être capable de dissoudre correctement l`analyte sur une gamme relativement large de concentration (au moins aussi élevé que dans les échantillons que vous souhaitez tester). De plus, ce solvant devrait idéalement être assez similaire à la "phase mobile:" le solvant utilisé pour transporter des échantillons à travers l`instrument de HPLC.

Calculer la quantité d`analyte nécessaire pour obtenir une solution "stock standard" de l`analyte. Il se trouve en multipliant la concentration requise de la norme du stock par le volume souhaité. La concentration de la substance à analyser dans cette solution doit être d`au moins 10% plus élevée que la concentration de l`échantillon le plus élevé prévu. Si la concentration en fructose attendu le plus haut dans un échantillon de boisson gazeuse est de 8 grammes / 100 millilitres, alors le stock standard pourrait être faite à une concentration de 10 grammes de fructose / 100 millilitres. Un volume raisonnable est de 500 millilitres, donc 8/100 ml x 500 ml = 40 grammes de fructose serait nécessaire.

Peser la quantité requise d`analyte à un niveau approprié de précision. Souvent, une valeur de poids en grammes précis à une ou deux décimales est approprié, mais plus de précision peut être nécessaire pour certaines méthodes.

Transférer l`analyte pesé dans une fiole jaugée du volume nécessaire et ajouter le solvant désiré à la marque de remplissage sur le flacon. Utilisation d`un flacon volumétrique (plutôt qu`un gobelet gradué, par exemple) augmente la précision du stock valeur de concentration standard. Faire en sorte que toute la substance à analyser est transféré à l`utilisation flask- une partie du solvant pour laver dans, le cas échéant.

Boucher la fiole jaugée et secouez doucement ou inverser jusqu`à ce que l`analyte soit complètement dissous.

Faites une série de différentes dilutions de l`étalon boursier en transférant des volumes connus de la norme de stock en fioles jaugées, en utilisant des pipettes pour un transfert précis, puis en ajoutant un solvant. La concentration la plus faible niveau doit être inférieur à l`échantillon le plus bas prévu pour être analysé. Dans l`exemple des boissons gazeuses, si la concentration la plus faible teneur en fructose attendue dans un échantillon est de 2 g / 100 ml, puis une norme / 100 mL de 1 gramme pourrait être faite. Ce serait faite par une dilution de dix fois de la norme de stock. La série standard devrait inclure un total de 5 ou 6 concentrations, donc dilutions supplémentaires pour produire des normes de peut-être 3, 5 et 8 grammes de fructose / mL serait nécessaire. Vous avez maintenant une série de solutions standard avec qui pour calibrer la HPLC.