Quantifient votre échantillon d`ARN en mesurant son absorbance de la lumière ultraviolette (UV). Un spectrophotomètre nano-goutte va utiliser seulement un ou deux microlitres de votre échantillon, que vous pouvez récupérer. D`autres spectrophotomètres exigent un échantillon beaucoup plus large. Le coefficient d`extinction pour les nucléotides à une longueur d`onde UV de 260 nm dans un trajet lumineux de 1 cm est de 20. Sur la base de ce coefficient d`extinction, l`absorbance de 40µ-g / ml d`ARN dans les mêmes conditions est une. En utilisant cette information, vous pouvez calculer la concentration de votre échantillon d`ARN.
Choses que vous devez
- spectrophotomètre
- Calculatrice
Faire une dilution, le cas échéant, de votre échantillon. Une dilution standard pour une microcuvette est de 1:40. Faire de cette dilution en ajoutant 2&L `ARN des micro-échantillon à 78µ-L de l`eau stérile.
Suivez les protocoles de votre spectrophotomètre particulier pour calibrer la machine en utilisant un vide, puis déterminer la densité optique de votre échantillon à une longueur d`onde UV de 260nm.
Multipliez l`absorbance de votre échantillon par votre facteur de dilution de 40&mu g d`ARN / ml. L`équation serait: "la concentration de l`ARN (µ-g / ml) = (DO260) x (facteur de dilution) x (40µ-ARN g / ml) / (DO260 1 unité)" (Hofstra.edu) Par exemple: Si vous Dilué votre échantillon par 1:40 et votre lecture d`absorbance était de 0,08, vous devez multiplier 0,08 x 40 x 40 = 128 µ-g / ml = 0,13 µ-g /&mu-L
Calculez la pureté de votre échantillon en prenant une autre lecture de l`absorbance à la longueur d`onde 280nm UV. Le rapport DO 260 / DO 280 indiquera si - et à quel niveau - votre échantillon est contaminé par des protéines ou de phénol. Un résultat de 1,8 à 2,0 indique l`ARN de qualité.
