Pour déterminer le fonctionnement d`un gène dans une cellule par transfection d`un gène à surexprimer, il est essentiel d`assurer l`acide (ADN) clonage et ligature étape désoxyribonucléique impliquant un vecteur approprié est réussie. Si l`étape de ligature n`a pas réussi, ou si insert d`ADN est pas inséré dans le bon sens, les données seront ininterprétable, et il sera impossible de déterminer comment votre gène fonctionne dans la cellule.
Choses que vous devez
- Des amorces de PCR
- gel d`agarose à 3 pour cent
- plasmide non ligaturées
- Le plasmide ainsi insert d`ADN
- enzymes de restriction appropriées à insert d`accise
- glycérol 4x contenant un tampon de chargement
- le bromure d`éthidium ou un autre agent intercalant de l`ADN
Créer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) amorces pour votre insert incorporant un site de restriction roman dans l`amorce. Par exemple, votre amorce de PCR est de 18 nucléotides long à l`amont ou cinq prime (5 `) end ajouter la séquence canonique pour une enzyme de restriction qui ne sont pas déjà dans le plasmide. Cela permettra de clonage unidirectionnelle de l`insert dans le plasmide. Les séquences des sites de restriction peuvent être trouvés sur les sites Web de l`entreprise qui vendent les enzymes, telles que Current Protocols in Molecular Biology et New England Biolab, qui sont liés dans la section Ressources.
Déterminer la taille du produit de PCR. Pour ce faire, exécutez une aliquote du produit de PCR sur un gel d`agarose à 3 pour cent avec un marqueur approprié de poids moléculaire. Cela détermine également si oui ou non un seul produit a été amplifié.
Séquencer le produit de PCR.
Entrez séquence dans l`outil de recherche d`alignement local de base (BLAST, BLASTN) pour veiller à ce que seul le gène souhaité a été amplifié. L`outil de recherche est lié dans la section Ressources.
Digest le plasmide ainsi insérer en utilisant les enzymes de restriction appropriées. Pour ce faire, après que le produit PCR a été vérifiée et ligaturé dans le vecteur approprié. Suivez les instructions pour le temps de la digestion et de la température fournie par les enzymes.
Exécuter une aliquote du plasmide restreint dilué dans du tampon de charge 4x contenant du bromure d`éthidium ou un autre agent intercalant de l`ADN pour visualiser l`ADN sur un gel d`agarose. Si l`insert a été correctement ligaturé dans le plasmide, deux fragments doivent être visibles sur le gel.
Séquencer l`insert pour veiller à ce qu`il a été incorporé dans le bon sens. Faire en coupant le plasmide ainsi insérer en utilisant des enzymes de restriction qui sont en amont et en aval de l`insert. amorces Conception de séquençage qui incorporent certains de plasmide et insèrent ensemble dans la même amorce. Cela vous dira définitivement sur l`insertion et l`orientation.
