D`après le site Bioweb de l`Université du Wisconsin, une amorce de PCR est un oligonucléotide synthétique court (généralement entre 18 et 25 bases de long) utilisées pour amplifier des régions spécifiques de l`ADN dans une technique de biologie moléculaire connue sous le nom de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Les deux une amorce avant et arrière sont nécessaires, conçus pour être des compléments inverses du brin d`ADN, à flanc et se lier à la région d`ADN souhaitée. Quand les scientifiques veulent effectuer des recherches sur un gène ou une région d`ADN spécifique, ils doivent d`abord effectuer des PCR pour acquérir assez de la région cible à travailler avec. Concevoir des séquences d`amorces pour la région d`intérêt peut être nécessaire si elles ne sont pas déjà disponibles grâce à des recherches publiées précédemment ou par des moyens commerciaux.
Choses que vous devez
- la séquence nucléotidique de la région d`ADN cible
- logiciel de conception Primer ou site web
Obtenir la séquence nucléotidique de la région du gène ou de l`ADN d`intérêt et déterminer la durée d`un fragment que vous souhaitez amplifier. L`amorce avant et arrière est conçue pour se lier au début et à la fin du fragment souhaité. En règle générale, les méthodes de PCR classiques utilisent des amorces qui flanquent une région comprise entre 100 et 1000 paires de bases de long, alors que les méthodes de PCR en temps réel utilisent des fragments de 50 à 200 paires de bases de long.
Décidez où dans la séquence que vous voulez que les amorces de mentir. Par exemple, vous voudrez peut-être l`emplacement près de l`extrémité 5 `ou l`extrémité 3` de la séquence ou au milieu. Si on le désire, désigner l`emplacement des amorces pour enjamber un intron.
Suivez les recommandations pour la conception d`amorce. une amplification réussie du produit d`ADN dépend de la qualité des amorces et de certaines variables sont critiques.
Concevoir des amorces pour être de 18 à 24 bases de longueur. Vincent R. Prezioso, Ph.D., de Brinkmann Instruments Inc., suggère que cette longueur est suffisamment longue pour être extrêmement spécifique à la région d`ADN souhaitée, mais suffisamment courte pour lier (recuisson) facilement. température de fusion de l`amorce (Tm) doit se situer entre 55 à 80 degrés Celsius, suffisamment faible pour permettre la fusion totale égale ou supérieure à 90 degrés Celsius, mais suffisamment élevée pour permettre le recuit. La teneur en GC (pourcentage de S et C dans la séquence) doit se situer entre 40 et 60 pour cent. L`extrémité 3 `de la séquence d`amorce ne doit se terminer par un C ou un G (appelé une pince GC) afin de favoriser la liaison, étant donné que les nucléotides G et C ont des liaisons plus fortes, toutefois, éviter d`avoir trois ou plus Gs ou Cs dans les cinq dernières années bases de la séquence.
Évitez d`avoir séries de quatre ou plus d`une base (comme ACCCC ...) ou quatre ou plusieurs répétitions di-nucléotidiques (comme ATATATAT ...) car ils peuvent causer mésamorçage. La conception des amorces avec aucune homologie intra-amorce (plus de trois bases complémentaires à l`intérieur de l`une amorce lui-même) ou d`homologie entre l`amorce (où l`amorce directe et inverse ont des séquences complémentaires). Cela peut provoquer une auto-dimères ou des dimères d`amorces, où les amorces se lient à eux-mêmes au lieu de se lier à la séquence d`ADN souhaitée.
Utiliser les ressources en ligne et des sites Web qui aident à la conception primaire ou aident à vérifier les séquences d`amorce pour une auto-complémentarité ou le potentiel pour faire des structures secondaires comme des épingles à cheveux. Certains sites de conception d`amorce comprennent le Massachusetts Institute of Primer3 Technology, National Center for Primer-Blast Biotechnology Information et OligoAnalyzer de Integrated DNA Technologies.
